超分辨率顯微鏡助力沙門氏菌-宿主相互作用的研究

由於熒光顯微鏡的低分辨率和靈敏度以及缺乏觀察病原體的超微結構信息，宿主細胞內的胞內病原體的成像變得複雜。在此，作者提出了一種新的方法來觀察這些病原體在感染過程中的情況，從而避免了這些問題：通過對胞內病原體鼠傷寒沙門氏菌進行生物正交標記，並通過使用這些生物正交組來引入與隨機光學重建顯微鏡兼容的熒光團，並將其置於相關的光電子顯微鏡（CLEM）工作流程中，病原體可以在其宿主細胞環境鼠傷寒菌中成像，分辨率為20 nm。因此，-CLEM方法提供了一種了解這些病原體感染過程的新方法。

研究介紹（節選）

抗生素耐藥性的上升是全球健康的主要威脅之一。在這方麵，一類病原體被證明是特別麻煩的，這類病原體是細胞內細菌。它們通過在宿主細胞吞噬體中駐留和複製而阻礙免疫檢測。通過分泌操縱吞噬體成熟的因子，它們確保了它們在細胞內的存活，盡管哺乳動物宿主部署了大量的防禦機製，因此，在細胞和分子水平上理解細菌-宿主相互作用是J其重要的。生物正交化學已被證明是研究這些宿主-病原體相互作用的一項重大突破性技術。然而，目前bsports官网登录試用的標記方法要麽需要將對生物正交甲硫氨酸、苯丙氨酸或正亮氨酸類似物具有特異性的突變tRNA/tRNA合成酶對引入病原體以實現所需基團的摻入，要麽具有低靈敏度。這就限製了它們僅用於那些技術可用於的細菌菌株。

在過去的幾年裏，超分辨率成像技術蓬勃發展，實現了納米級的分辨率。作者在之前研究的基礎上，加入了超分辨率顯微鏡，這將有助於克服與病原體相關的障礙：隨機光學分辨率顯微鏡在實驗中靈敏度和改進的分辨率，使熒光信號的分辨率與TEM更接近，並提高檢測靈敏度，允許通過CLEM對遺傳未修飾的病原菌進行成像。

研究結果（節選）

使用-CLEM進行生命周期研究的一種病原體是鼠傷寒沙門氏菌（以下簡稱沙門氏菌）。鼠傷寒杆菌或沙門氏菌）。這是一種革蘭氏陰性兼性胞內病原體，通過攝取後分泌各種效應蛋白來確保其在胞內存活。它們調節細菌所駐留的吞噬體的成熟，以產生適合其生存和複製的寄生泡。為了將bsports官网登录的-CLEM應用於沙門氏菌的成像，bsports官网登录首先評估了bsports官网登录是否可以通過使用BONCAT將生物正交氨基酸類似物摻入到足夠的水平，以允許在被吞噬細胞攝取後對細菌蛋白質組進行ccHc檢測，而不影響細菌的生長和感染性。

圖2 用Hpg-S處理的BM-DC 75 nm冷凍切片的超分辨率N--CLEM圖像。

鼠傷寒將BM-DC與Hpg-S孵育。用磷酸鹽緩衝液洗滌以除去未結合/未內化的S.鼠傷寒將細胞固定並進行Tokuya樣品製備，並冷凍切片成75 nm切片。在ccHc條件下（紅色），用Alexa-647-疊氮化物處理切片。左圖：Hpg-S超分辨率N-成像的示例A）1和B）2。鼠傷寒右圖：左側麵板的超分辨率CLEM圖像。箭頭表示吞噬體外信號。比例尺：250 nm。

結果表明，熒光標記Hpg-S的準確性和檢測靈敏度均優於對照組。圖像的鼠傷寒沙門氏菌感染率明顯高於低分辨率共聚焦圖像。隨後通過電子顯微鏡觀察細胞內環境顯示沒有破壞吞噬細胞的超微結構。發現膜是完整的，並且相對於那些沒有通過分析的區域，在經過成像的樣品區域之間沒有觀察到結構變化。細胞器根據其獨特的形態學外觀很容易識別。圖像的相關性表明生物正交信號主要在沙門氏菌或寄生液泡周圍直徑約為10-20 nm的小結構上。

這是D一個使用生物正交組的超分辨率隨機光學重建顯微鏡（）-相關光電子顯微鏡（CLEM）及其在宿主-病原體相互作用研究中的應用的例子，因此可以用來在空間上詳細的宿主環境中觀察非轉基因病原體。與作者的方法和以前報道的方法相比，的靈敏度甚至允許檢測細胞外蛋白產物。這開啟了成像病原體的可能性，對於這些病原體，先前的生物正交非規範氨基酸標記（BONCAT）方法是無效的。CLEM與BONCAT、tRNA/tRNA合成酶突變體或生物正交細胞壁標記的組合將對研究這些病原體的體內生命周期有價值。將這一技術應用於生物正交化學已經發生變革的其他領域，也將為這些領域增加一個額外的超微結構維度。

參考文獻References

[1] G. Mitchell, R. R. Isberg, Cell Host Microbe 2017, 22,166–175.
[2] S. Pandey, T. Kawai, S. Akira, Cold Spring Harbor Perspect. Biol. 2015, 7,a016246.
[3] a) M. S. Siegrist, S. Whiteside, J. C. Jewett, A. Aditham,F.Cava, C. R. Ber-tozzi, ACS Chem. Biol. 2013, 8,500–505;b)P.Shieh,M.S.Siegrist, A. J.Cullen, C. R. Bertozzi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2014, 111,5456–5461;c) G. W. Liechti, E. Kuru, E. Hall, A. Kalinda,Y.V.Brun, M. VanNieuwenhze,A. T. Maurelli, Nature 2014, 506,507–510.
[4] a) B. M. Swarts, C. M. Holsclaw, J. C. Jewett, M. Alber,D.M.Fox, M. S.Siegrist, J. A. Leary,R.Kalscheuer,C.R.Bertozzi, J. Am. Chem. Soc. 2012,134,16123–16126; b) K. M. Backus,H.I.Boshoff, C. S. Barry,O.Boutur-eira, M. K. Patel, F. D’Hooge, S. S. Lee, L. E. Via, K. Tahlan, C. E. Barry,B.G.Davis, Nat. Chem.Biol. 2011, 7,228–235;c)F.P.Rodriguez-Rivera, X.Zhou, J. A. Theriot, C. R. Bertozzi, J. Am. Chem. Soc. 2017, 139,3488–3495.
[5] D. C. Dieterich, A. J. Link, J. Graumann, D. A. Tirrell, E. M. Schuman, Proc.Natl. Acad. Sci. USA 2006, 103,9482–9487.
[6] A. Mahdavi,J.Szychowski, J. T. Ngo, M. J. Sweredoski, R. L. Graham, S.Hess, O. Schneewind,S.K.Mazmanian, D. A. Tirrell, Proc. Natl. Acad. Sci.USA 2014, 111,433–438.
[7] a) M. Grammel, P. D. Dossa, E. Taylor-Salmon,H.C.Hang, Chem.Commun. 2012, 48,1473–1474;b)M.Grammel, M. M. Zhang, H. C.Hang, Angew.Chem. Int. Ed. 2010, 49,5970–5974; Angew.Chem. 2010,122,6106–6110; c) S. Lin, Z. Zhang, H. Xu, L. Li, S. Chen, J. Li, Z. Hao,P. R. Chen, J. Am. Chem. Soc. 2011, 133,20581–20587.
[8] J. T. Ngo, J. A. Champion, A. Mahdavi, I. C. Tanrikulu, K. E. Beatty, R. E.Connor,T.H.Yoo,D.C.Dieterich,E.M.Schuman,D.A. Tirrell, Nat.Chem.Biol. 2009, 5,715–717.
[9] A. G. Chande, Z. Siddiqui,M.K.Midha, V. Sirohi, S. Ravichandran, K. V. S.Rao, Sci. Rep. 2015, 5,13430.
[10]R.Hatzenpichler,S.A.Connon,D.Goudeau,R. R. Malmstrom,T.Woyke,V. J. Orphan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2016, 113,E4069–E4078.

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