Nature Photonics | 無需熒光標記，新型超分辨顯微鏡“寫生”活細胞

看到感興趣的照片，bsports官网登录會情不自禁點開放大。但這種放大不是無限的，Z終bsports官网登录的好奇心會終止在一個模糊的像素點，無法更清晰。是光的內稟屬性造成了這一限製。突破光學衍射J限是科學界很有名的挑戰之一，至今仍沒有很好的方案。浙江大學物理學院張德龍研究員課題組另辟蹊徑，提出“從頻域提取空間特征”的思路，發明了一種無標記的超分辨率方法——光熱弛豫定位（PEARL）顯微鏡。PEARL顯微鏡直接從光熱顯微鏡的探測光束的位置依賴性調製中提取亞衍射J限特征，它不依賴於熒光標記，分辨率可達到120納米左右。

相關研究成果以“Super-Resolution Imaging of Non-fluorescent Molecules by Photothermal Relaxation Localization Microscopy” 為題1月23日在線發表於Nature Photonics。論文**作者為浙江大學物理學院博士生傅鵬程，通訊作者是浙江大學物理學院張德龍研究員。

尋找光斑裏的細節

張德龍的實驗室，無菌細胞房緊挨著光學儀器平台。他希望有一天生命體的精細結構能被更清晰、更便捷地觀察，這一領域存在一項很有名的挑戰：突破衍射J限。

衍射J限是由光的“本性”決定的。光是一種電磁波，由於存在衍射現象，一個被觀測的點經過光學係統成像後得到的是一個衍射像，每個物點就像一個彌散的斑。當兩個點靠得很近時，彌散斑就像“粘”一起，是一團模糊的圖像。1873年，德國科學家阿貝提出了“衍射J限”理論：分辨率的J限近似於入射光波長的二分之一(d=λ/2)。該理論認為，bsports官网登录觀察物體時的分辨率J限，取決於bsports官网登录用什麽波長的光去觀察。這類似於bsports官网登录畫畫，使用什麽樣的筆決定了筆觸的精細程度，是奔放的潑墨山水，還是細致的花鳥工筆。

圖1. 艾裏斑與瑞利判據。

（圖片來源：//www.opticsjournal.net/M/Articles/OJbf8d38a472e80dcb/FullText）

可見光的波長通常在380~780納米之間，根據衍射J限公式可以得出，傳統光學顯微鏡的分辨率J限在200納米（0.2微米）左右。這個分辨率在觀察更小的細胞結構時（例如脂質或蛋白質微滴）就顯得捉襟見肘了。也許你會說，可以用更短波長的光來提高成像分辨率，但是短波長的光具有的更高的光子能量，這會對細胞造成嚴重損傷。

在科學家眼中，J限就是用來突破的。多年來，突破衍射J限已經成為科學界一項公認的挑戰，眾多科學家提出了超分辨的思路與方法並應用於實際。Z具有代表性的是2014年獲得諾貝爾化學獎的超分辨熒光顯微技術。借助熒光分子的幫助，科學家將光學顯微成像技術的J限拓展到了納米尺度。

“2014年諾獎為代表的超分辨顯微成像技術嚴重依賴於熒光標記，實際bsports官网登录看到的是熒光標記，而不是觀測對象本身。”張德龍介紹，近年來，擺脫熒光依賴，利用“無標記”實現超分辨成像的科學探索開始成為研究熱點，有望能為下一代顯微鏡提供新的技術方案。在這篇研究論文中，浙大團隊提出了他們的全新方案：基於光熱弛豫定位顯微鏡（Photothermal Relaxation Localization Microscopy, PEARL）的非熒光分子超分辨成像係統。

來自海市蜃樓的啟發

bsports官网登录可以把海市蜃樓現象作為了解PEARL的入口。海市蜃樓是光線在在密度不同的氣層中穿行時發生折射的結果，就像光穿過透鏡，讓原本直線傳播的光線發生了偏折。張德龍說，PEARL就是試圖在被觀測物中引入“透鏡”，讓成像係統通過捕捉電磁波的“偏折”信息，從而獲得精確的圖像。

分子在遇到特定波長的電磁波時，會吸收電磁波能量並加速分子振動。微波爐就是利用了這一原理對食物進行加熱的。當電磁波消失後，加熱後的分子就進入能量耗散的放熱階段，這在物理學中被稱為光熱弛豫。對於科學家想觀察的生物細胞來說，雖然組成細胞的同一類分子吸收的能量是一樣的，但是他們的光熱升溫效果在空間上有所區別，總的來說是中心處升溫大，邊緣處升溫小。而當電磁波消失，邊緣的熱量要比中心的熱量耗散得更快。

圖2. PEARL成像原理

“bsports官网登录利用分子的熱弛豫現象，將分子吸收能量的特征和其空間位置信息聯係起來。通過捕捉不同熱弛豫過程的高頻差異，對特定的分子進行定位。”張德龍介紹。bsports官网登录不妨想象夜空裏星星“眨眼睛”的情景，星星忽明忽暗地閃爍，實際上是由於大氣密度分布不均勻造成光線的偏折造成的。“PEARL技術就好比通過‘眨眼’的快慢程度，來分辨出星星的細節。”

PEARL係統主要由泵浦光和探測光組成。泵浦光是波長可調諧的激光，用於激發特定的分子，它以脈衝的形式聚焦到目標物體上，引發分子光熱弛豫；探測光則進行持續的掃描，通過分子的“熱弛豫”形成的“熱透鏡”序列擾動探測光的傳播，這種擾動的信號裏蘊含著分子的位置和光譜信息。由於“熱透鏡”的存在，擾動的探測光產生了時間和空間上的變化。這一調製效應帶來的突破是：在高次諧波頻率上，能夠探測到更精細的空間結構，能夠突破探測光的衍射J限分辨率。

圖3. PEARL成像表征

為活細胞“寫生”

在研究中，浙大團隊展示了用PEARL來觀察酵母細胞中一類細胞器—脂滴。酵母是生物學上廣泛使用的模型生物。單個酵母細胞大小約2 - 4 微米，而其內部的脂粒通常隻有0.05—0.5微米左右，傳統的紅外成像方法無法對活細胞進行高分辨觀察。他們首次使用PEARL顯微鏡對酵母細胞進行亞細胞遠場紅外振動光譜成像。實驗不僅成功展示了細胞內的脂滴的分布情況，還測定了它們的大小分布。此外，實驗還發現了小尺寸的脂滴和一對蛋白滴（每個約170 納米）之間有細微的空間分離結構。“bsports官网登录在酵母的V-PEARL成像中觀察到的Z小特征是86 納米，這是**次用遠場紅外成像分辨出100 納米以下的特征。”博士生傅鵬程介紹到。

圖4. PEARL哺乳動物細胞成像

圖5. PEARL酵母細胞成像

當前，超越衍射J限的光學成像已經形成巨大的突破。與廣泛采用的基於熒光的方法相比，無標記成像避免了標記的需要和相關的潛在細胞毒性問題。然而，現有的非熒光的超分辨成像方法往往依賴於飽和效應或者非線性，其普遍適用性受到這些因素的限製。“bsports官网登录開發的是一種無標記的超分辨率方法，並突破了上述限製。”張德龍強調，該技術不需要特殊的吸收體，因為PEARL依賴於一般的吸收過程，包括電子和振動吸收。“bsports官网登录相信，PEARL可能為非熒光分子的超分辨率成像開辟了新的途徑，在生物學、醫學和材料科學領域獲得令人興奮的廣泛應用。”

此項工作得到了國家自然科學基金（12074339，32050410293，11934011），量子科學技術創新計劃（2021ZD0303200），浙江大學腦與腦機融合前沿科學中心資助項目，中央高校基本科研業務專項資金的支持。

論文鏈接：

//www.nature.com/articles/s41566-022-01143-3

原文章鏈接：//physics.zju.edu.cn/2023/0214/c39070a2715958/page.htm