各廠家超分顯微鏡技術的介紹

1、 萊卡公司采用的超分辨技術 STED
2000 年，德國科學家 StefanHell 開發了另一種超高分辨率顯微技術，其基本原理是通過物理過程來減少激發光的光斑大小，從而直接減少點擴散函數的半高寬來提高分辨率。當特定的熒光分子被比激發波長長的激光照射時，可以被強行猝滅回到基準態。利用這個特性，Hell 等開發出了受激發射損耗顯微技術 (stimulated emission depletion，STED)。其基本的實現過程如圖 2 所示，就是用一束激發光使熒光物質(既可以是化學合成的染料也可以是熒光蛋白)發光的同時，用另外的高能量脈衝激光器發射一束緊挨著的、環型的、波長較長的激光將第Y束光斑中大部分的熒光物質通過受激發射損耗過程猝滅，從而減少熒光光點的衍射麵積，顯著地提高了顯微鏡的分辨率，原理見下圖。

STED 成像技術的*大優點是可以快速地觀察活細胞內實時變化的過程，因此在生命科學中應用更加廣泛。

2、 蔡司公司采用的超分辨技術 PLAM
2002 年，Patterson 和 Lippincott‐Schwartz 首次利用一種綠色熒光蛋白(GFP)的變種(PA‐GFP)來觀察特定蛋白質在細胞內的運動軌跡。這種熒光蛋白 PA‐GFP 在未激活之前不發光，用 405nm 的激光激活一段時間後才可以觀察到 488nm 激光激發出來的綠色熒光。德國科學家EricBetzig 敏銳地認識到，應用單分子熒光成像的定位精度，結合這種熒光蛋白的發光特性，可以來突破光學分辨率的J限。2006 年 9月，Betzig 和 Lippincott‐Schwartz 等首次在 Science 上提出了光激活定位顯微技術(photoactivated localization microscopy，PALM)的概念。其基本原理是用 PA‐GFP 來標記蛋白質，通過調節 405nm 激光器的能量，低能量照射細胞表麵，一次僅激活出視野下稀疏分布的幾個熒光分子，然後用 488nm 激光照射，通過高斯擬合來精確定位這些熒光單分子。在確定這些分子的位置後，再長時間使用 488nm 激光照射來漂白這些已經定位正確的熒光分子，使它們不能夠被下一輪的激光再激活出來。之後，分別用 405nm 和 488nm 激光來激活和漂白其他的熒光分子，進入下一次循環。這個循環持續上百次後，bsports官网登录將得到細胞內所有熒光分子的精確定位。將這些分子的圖像合成到一張圖上，*後得到了一種比傳統光學顯微鏡至少高 10 倍以上分辨率的顯微技術，原理如下：

PLAM 通過定位細微結構乃至單分子，實現 20 nm 的橫向分辨率和 50 nm 軸向分辨率。

3、 尼康公司采用的超分辨技術 STROM 和 SIM STROM
2006 年底，美國霍華德‐休斯研究所的華裔科學家莊曉薇實驗組開發出來一種類似於 PALM 的方法，可以用來研究細胞內源蛋白的超分辨率定位。他們發現，不同的波長可以控製化學熒光分子 Cy5 在熒光激發態和暗態之間切換，例如紅色 561nm 的激光可以激活 Cy5 發射熒光，同時長時間照射可以將 Cy5 分子轉換成暗態不發光。之後，用綠色的 488nm 激光照射 Cy5 分子時，可以將其從暗態轉換成熒光態，而此過程的長短依賴於第E個熒光分子 Cy3 與 Cy5 之間的距離。因此，當 Cy3 和 Cy5 交聯成分子對時，具備了特定的激發光轉換熒光分子發射波長的特性。將 Cy3 和 Cy5 分子對膠聯到特異的蛋白質抗體上，就可以用抗體來標記細胞的內源蛋白。應用特定波長的激光來激活探針，然後應用另一個波長激光來觀察、精確定位以及漂白熒光分子，此過程循環上百次後就可以得到*後的內源蛋白的高分辨率影像，被他們命名為隨機光學重構顯微技術 (stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)。2007 年，他們進一步改進 STORM 技術，發展了不同顏色的變色熒光分子對，可以同時記錄兩種甚至多種蛋白質的空間相對定位，從而闡明籠形蛋白 clathrin 形成的內吞小泡與細胞骨架蛋白之間的精確空間位置關係，兩種顏色的分辨率都可以達到 20～30nm。原理如下圖：

STORM 通過一對染料對通過隨機發光空間定位，實現了 XY 20 nm 分辨率。

SIM
改變光學的點擴散函數來突破光學J限的另一個方法是利用飽和結構照明顯微技術(saturated structure illumination microscopy，SSIM)。早在 1963 年，Lukosz 和 Marchand 就提出了特定模式側向入射的光線可以用來增強顯微鏡分辨率的理論。2005 年，加州大學舊金山分校的 Gustafsson 博士首先將非線性結構性光學照明部件引入到傳統的顯微鏡上，得到了分辨率達到 50nm 的圖像。SSIM 技術的原理是將多重相互衍射的光束照射到樣本上，然後從收集到的發射光模式中提取高分辨率的信息。如圖所示：

SIM 通過結構照明莫爾紋原理實現了任何熒光染料都可以達到 XY 100nm。 

4、 奧林巴斯公司采用的 OSR 技術
圖像超分辨率重構(super resolution。SR)是指利用計算機將一幅低分辨率圖像（low resolution，LR）或圖像序列進行處理，恢複出高分辨率圖像（high resolution，HR）的一種圖像處理技術。奧林巴斯超分辨技術通過高倍 60X 或者 100X 油鏡，通過縮小共聚焦上的針孔，用強激光將樣品掃描 20~50 次後通過軟件進行運算重構，此技術存在一定的局限性：
①要使用高倍油鏡低倍不適用
②因縮小針孔需使用強激光對樣品損傷比較大。
③對樣品掃描 20~50 次，樣品熒光淬滅嚴重，更不適用於活細胞。
④環境要求較高，在做 20~50 次的過程中因環境振動等引起*後軟件運算不準確。
⑤共聚焦圖片均為軟件著色，不能做多色熒光標記，容易引起串色。