浙大學者研發新型超分辨成像技術，兼容現有熒光技術並能追蹤特定蛋白，無需熒光標記即可實現超分辨成像

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“作為一個大規模、高水平的科研平台，浙大具有很大的吸引力。回來以後，我所在的物理學院給到了大力支持，讓我可以安心地作科研。By the way，我在陝西長大，但祖籍是在紹興。當時，由於戰亂導致祖輩不得不背井離鄉逃難到西部。而今我回到浙大、回到家鄉，冥冥之中也與浙大西遷精神互相契合。”浙江大學物理學院百人計劃研究員張德龍說。

圖 | 張德龍（來源：張德龍）

2019 年，在美國讀完博士並完成博後研究之後，張德龍回國加入浙江大學，主要研究方向是分子光譜成像與交叉前沿技術。

Z近，他和團隊開發出一項基於光熱弛豫定位的超分辨成像技術（PEARL，photothermal relaxation localization）。在生物、醫學和材料科學等領域，這些技術可以發揮傳統熒光超分辨技術所無法替代的無標記定位優勢，具備廣泛的應用前景。

PEARL：兼容現有熒光技術，並能追蹤特定蛋白

簡單來說，張德龍提出了一種新型顯微鏡技術，可以通過光熱弛豫實現非熒光分子的超分辨率成像。它擺脫了傳統超分辨成像技術對於熒光標記的依賴，可以直接進行超分辨成像。

近年來，超分辨技術已經發展成為一項熱門技術。2014 年，憑借在超分辨技術方麵的貢獻，美國應用物理學家埃裏克·白茲格（Eric Betzig）、德國物理學家史蒂芬·赫爾（Stefan W. Hell）、以及美國化學家威廉·默爾納（William Esco Moerner）共同獲得諾貝爾化學獎。

光學技術屬於物理範疇，理應給他們頒發物理獎。而諾獎委員會的回答是：以前的分辨率高低取決於透鏡磨的好壞，而今天分辨率的突破是由於人類找到並合成了神奇的熒光分子。

熒光標記技術在今天已經非常成熟，無疑是應用Z廣泛的光學技術之一。然而，沒有任何技術是完M的。所謂“成也蕭何敗蕭何”，熒光技術依舊受限於對熒光分子的依賴，並存在光漂白、標記效率低和選擇性差等問題。

在過去十年中，盡管超分辨率熒光技術已經漸入佳境，但是非熒光超分辨率顯微鏡的發展仍有很大的空間。長期以來，光學成像領域的學者們一直在尋找無標記超分辨技術，但卻苦於缺乏一個廣泛適用的技術。

在常見的成像方式中，光熱顯微鏡是一種強大的技術，具有高靈敏度和通用性，可以兼容電子吸收和振動吸收。

而張德龍此次研發的基於光熱弛豫定位的超分辨成像技術，正是通過對光熱效應的時間特征進行探測，實現了突破衍射J限的無標記成像。研究中，他和團隊利用位置相關的光熱耗散，打破了光熱顯微鏡的分辨率J限。

該技術還具備廣泛的適用性，即針對光學吸收的分子或結構，基本都可以突破衍射J限進行成像。

相比而言，現有的無標記超分辨技術，其應用大多限製於特定體係或分子結構，並不具有廣泛適用性。

論文中，張德龍課題組還展示了中紅外區的分子振動光譜，在脂質和蛋白質的特征峰的成像能力，也展示了以金納米顆粒為代表的電子吸收光譜在可見光區的成像能力。

這兩個模式覆蓋了從可見光到中紅外（約 400nm~10000nm）的光譜範圍，都是具有代表性的光譜學應用案例，也充分證明了基於光熱弛豫定位的超分辨成像技術的廣泛適用性。

同時，以酵母模型為例，該團隊還展示了這項技術在生物等方麵的研究潛力。

（來源：Nature Photonics）

通過紅外吸收特征峰，他們選擇性地對空間聚集的脂肪和蛋白質分子進行超分辨成像。在傳統方法裏，對脂肪等小分子代謝物的熒光標記往往比較困難，一般是通過特定蛋白間接進行探測，但即便如此也很難做到定量化。

而基於光熱弛豫定位的超分辨成像技術，可以直接對脂肪進行無標記超分辨成像，能對生物代謝等過程進行前所W有的精確觀測，對於解密生物過程具有不可替代的價值。

此外，這項技術也能兼容現有的熒光技術，可以在分子成像基礎上同時進行免疫熒光對於特定蛋白的追蹤。

值得一提的是，在熒光成像中一般超過 3 個同時標記就會比較困難。而分子光譜譜峰的寬度一般很窄，具備同時追蹤多個分子的能力。

此前，就有其他團隊同時進行幾十個不同分子的追蹤 [1], 而張德龍課題組研發的基於光熱弛豫定位的超分辨成像技術，也沿襲了這種高通量光譜複用優勢。

從上網時用的“貓”說起

據介紹，本次工作是在張德龍前期成果的基礎上展開的 [3]，即通過光熱效應所衍生的超靈敏探測技術，來對光學吸收進行觀測，並將其應用於紅外成像，借此突破了傳統紅外成像的局限，實現了三維、亞微米分辨率的活細胞成像。

張德龍表示：“對於 PEARL 這項工作來說，Z開始還是比較偶然的。”這就不得不提到調製（modulation）技術。在工程上，調製技術應用J為廣泛，從收音機到 5G 通訊都少不了這個技術。

比如，bsports官网登录上網時用到的“貓”就是 modem 的俗稱，它是 modulator-demodulator（調製解調器）的縮寫。調製技術的核心其實很簡單，好比bsports官网登录開車時會用到閃車燈，從而讓汽車從紛繁複雜的周圍環境中“跳”出來。

科研領域也經常用到調製，就是把激發光在頻率 f 進行“閃爍”（即調製），然後用探測器在頻率 f 上探測這個“閃爍”（即解調），借此可以提高信噪比。

張德龍表示：“學界對於調製技術的認知，一直以來也是這樣延續的，沒有人去探索更多的應用潛力。但從來如此就是對的嗎？於是我在回國後，開始了這方麵的探索。”

對於在探索中的發現，張德龍舉例稱：小時候bsports官网登录玩的“紅白機”遊戲，其中的音樂聲音很奇怪，同樣是一個 C 大調，但卻遠遠比不上鋼琴的音色。

這是因為合成音樂可以產生純正弦的振動，而鋼琴的琴弦沒法產生純正弦的振動，其中伴隨著很多“不完M”的振動，這在物理上會產生很多倍頻的振動，這一現象一般稱為諧波。而對於這樣的聲音，人耳會感到更加自然。

意識到這一點之後，張德龍和課題組開始觀察諧波頻率上的信號，Z開始他們想把這些信號都加起來，從而更進一步提高信噪比（通過利用這一想法，另一研究組做出了獨立研究成果）。

但是，讓張德龍沒想到的是，諧波頻率上的成像結果與原圖並非完全一致。這讓他感到非常出乎意料，在好奇心的驅動之下，便有了這次課題的開端。

正式立項以後，他和團隊以微球係統為準，深入研究了掃描成像分辨率與諧波階次的關係。得到可重複的結果之後，逐步地大膽開展活細胞成像的研究。

期間，他們注意到 PEARL 的物理原理，同樣適用於一般的光熱現象。於是，又開始研究電子吸收的光熱成像，並選擇納米結構這樣一個Z具代表性的材料成像，借此讓 PEARL 分辨率的提升得到了驗證。

（來源：Nature Photonics）

然而，張德龍卻用“一波三折，命途多舛”來形容整個研究過程。他說：“疫情的影響自不用說，期間bsports官网登录的實驗中斷了不止一次。並且在實驗中，Z核心的一個激光器在安裝運行一周之後，有一個控溫模塊毫無征兆地突然壞掉了，而且要返廠維修。”

在此情況下，他們使用這台“半壞”的激光器，終於趕在返修提貨的前一周完成了實驗。

另外，有一部分實驗要在紅外飛秒係統裏完成。當時激光器的狀況很差，大概每隔三個月就得讓工程師上門維修一次，研究進度也被嚴重掣肘。

而Z為艱苦的是，在做可見光泵浦成像的實驗時，他們手頭沒有光源。後來，張德龍在研究所裏上上下下地找，終於借到了閑置的紅光激光和綠光脈衝激光，確保了實驗驗證的完成。

他繼續說道：“很有緣分的是，本文**作者傅鵬程是加入bsports官网登录組的**個博士生。鵬程也從做實驗時衣服被激光燒出洞洞的‘小白’，成長為可以獨立操作係統的科研人員。有一天他神情凝重地告訴我，他把bsports官网登录十幾萬的掃描平台搞壞了。後來認真排查原因，發現是新版本驅動之後，引腳的定義被修改了，原來是虛驚一場。這些大大小小的事情鍛煉了學生的‘debug’能力，也讓bsports官网登录造就了一套科研方法學。”

Z終，相關論文以《光熱弛豫定位顯微鏡對非熒光分子的超分辨率成像》（Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy）為題發在 Nature Photonics 上，傅鵬程是**作者，張德龍擔任通訊作者 [2]。

圖 | 相關論文（來源：Nature Photonics）

事實上，PEARL 也是近年來的新興前沿方向之一，因此張德龍也將繼續深入探索。一方麵，他們希望可以進一步優化係統性能，比如提高采集帶寬和通量、提高分辨率等；另一方麵，在應用拓展上他們也將進行更多的外部合作，同時會在紅外超分辨成像領域開發更加新穎的成像技術。

參考資料：

1.Nature 544, 465–470 (2017)

2.Fu, P., Cao, W., Chen, T.et al. Super-resolution imaging of non-fluorescent molecules by photothermal relaxation localization microscopy. Nat. Photon. (2023). //doi.org/10.1038/s41566-022-01143-3

3.Science Advances 2, e1600521 (2016)