中科院生物物理所在超分辨顯微鏡研製領域取得進展，你怎麽看？

哺乳動物的DNA複製是在許多複製起點開始的，這些複製起點聚集在整個基因組的數千個複製域（RD）中。然而，目前尚不清楚每個RD內的複製起源是隨機激活還是優先在某些染色質特征附近激活。

一.研究介紹

為了了解單個人類細胞中的DNA複製是如何在亞RD水平上調節的，作者使用STORM以超高分辨率直接可視化和定量表征跨S期的單個複製點（RFi）的時空組織、形態和原位表觀遺傳特征，揭示了RFi傳播動力學的分級徑向模式。

結合模擬和生物信息學分析，指出了一種“CTCF組織的複製繁殖”（CoREP）模型，該模型表明早期S期亞RD水平複製激活的非隨機選擇機製，由CTCF有組織的染色質結構介導。這些發現為局部表觀遺傳環境在協調基因組DNA複製中的關鍵作用提供了重要的見解。

二.研究結果（節選）

在S期的特定階段，向細胞提供染料標記的dUTP或EdU，將這些類似物分子結合到分裂期中DNA中，用STORM對標記的RFi進行成像，揭示了點狀分布以及跨S期，STORM（20 nm） 提供的好的空間分辨率能夠對RFi進行更準確的定量表征，特別是對於基於數十納米內多色共定位分析的後續發現。

圖1. 跨S期RFi的STORM成像和定量表征

單個HeLa細胞核中RFi的常規和STORM圖像，在S期的五個不同階段（從左到右，每個階段有30分鍾的標記）。插圖（紅色框）顯示每個階段單個RFi 的放大代表性圖像。頂部的橙色條表示S期標記周期的相對時間位置。

為了研究以亞衍射JI限分辨率複製DNA的局部染色質環境中的動態變化，作者使用兩種光譜不同的染料Alexa 647和Cy3B原位共標記RFi和與各種表觀遺傳特征相關的七個關鍵核標記，並進行雙色STORM成像以量化它們的共定位。在這些標記中，已知CTCF通過形成染色質環來調節3D染色質結構，組蛋白修飾的H3K27ace和H3K4me3與轉錄活性染色質相關，核層定位的層粘連蛋白 A/C主要與轉錄抑製的DNA 相關，而SUZ12構成組蛋白H3的抑製複合物的一部分，增殖細胞核抗原（PCNA）是哺乳動物複製的重要組成部分，它與H2B一起作為陽性對照。

圖2. RFi相關表觀遺傳特征在S期原位的動力學

（A–G）RFi和七個關鍵核標誌物之間的共定位分析揭示RFi在整個S期的不同局部染色質狀態。在S期早期（頂部），中期（中間）和晚期（底部）開始時標記的新複製DNA（粉紅色）的細胞，隨後用針對每個標記物（綠色）的抗體進行免疫標記，並用雙色STORM成像。

為了探測單個RFi的空間組織和動力學，作者研究DNA複製在空間和時間上的傳播模式。為此，在S期三個不同階段的兩個連續30分鍾時間窗口內用兩種光譜不同的染料Alexa 647和Atto 550標記新複製的DNA，此外，核層中的層粘連蛋白A/C用第三種染料Atto 488。在標記細胞的多色STORM成像中，兩個時間窗口的相對空間分布揭示了RFi進展的獨特時空模式。

圖3. S期早期和晚期的RFi表現出相反的傳播動力學時空模式

30分鍾窗口（紫色和綠色）內新複製的DNA（紫色：第Y個窗口;綠色：第E個窗口;白色：共定位RFi）與層粘連蛋白A/C（藍色）一起標記每個細胞的核邊界。頂部的紫色和綠色條表示S期標記周期的相對時間位置。插圖（編號為1到6）顯示放大區域（紅色框），顯示兩種顏色之間的正常對比度（頂部）和增強對比度（中），以獲得更好的可視化效果。

為了理解RFi傳播獨特模式背後的機製基礎，CTCF通過形成染色質環在調節3D基因組結構中發揮的突出作用，作者使用RNA幹擾物降低HeLa細胞中的CTCF表達，使用免疫染色在蛋白質水平上證實了這一點，結果表明，CTCF及其介導的染色質環結構是RFi形態和傳播動力學的關鍵調節因子。

圖4. CTCF調節RFi形態和時空傳播動力學

（A）用非特異性對照（NC）或CTCF siRNA轉染的細胞核中S期早期RFi的STORM圖像。插圖（藍色）顯示了CTCF在RNA幹擾下的成功下調。（D）在用NC或CTCF siRNA處理的細胞核的S期早期開始時，在兩個連續的30分鍾窗口（紫色和綠色）中標記的新複製DNA的雙色STORM圖像。

總之，作者的研究為進一步詢問DNA複製和其他相關核內過程的時空組織和動力學鋪平了道路，為理解複製和轉錄之間的耦合提供了一個框架，因為轉錄活性啟動子周圍的開放染色質可以促進附近複製起源的選擇，這可能反過來解釋轉錄活性基因傾向於早期複製的觀察結果。