做超分辨顯微鏡實驗，如何尋找到合適的熒光抗體呢？

先來聊聊目前幾種常見的SRM（超分辨顯微鏡）技術原理：

一、受激發射耗竭（STED）顯微鏡

STED對於有經驗的熒光顯微鏡使用者來說相對簡單，該方法和普通共聚焦顯微鏡（Confocal）的原理相同。普通Confocal使用單光源，而STED使用雙光源。其中一個光源發射能激發熒光團——熒光標簽（研究者們以此來定位和觀察蛋白）的光，另一個光源發出不同波長的光，用於抑製熒光。這束光是環形的，並且與**束光有所重疊，因此隻有環形中間區域的分子會繼續發出熒光。

獲得STED超分辨率圖片並沒有那麽複雜，用戶需要仔細調整參數，才能得到漂亮的結果，否則所得圖片和普通confocal沒有差別。

使用傳統和RESCue受激發射減損顯微鏡（STED）得到的細胞核膜上核孔複合體的圖片。

STED的原理：

顯微鏡透鏡對光的衍射會導致來自單個點的光出現在較大的區域，這稱為點擴散函數（PSF），由於PSF的存在，使得常規顯微鏡無法達到超分辨。

在普通光學顯微鏡中，成像是通過將來自點光源的光線會聚到像平麵上的單個點來實現的。超出光衍射的限製，防止了射線的精確會聚，從而導致物體的圖像模糊。顯微鏡的分辨率取決於點擴散函數（PSF）的大小，或對象在某個點的三維強度分布。在STED中，應用環形炸彈耗盡型激光器，其零點與激發激光焦點的*大值重疊。STED激光器引起熒光的“飽和耗盡”，從而“抑製了來自零點附近區域的熒光，導致有效PSF的尺寸減小”。

而受激發射耗竭（STED）顯微鏡通過限製樣品的熒光區域（PSF）產生超分辨率圖像。STED顯微鏡使用兩個重疊的激光，**個按照常規顯微鏡激發熒光團（圖2A）。第二個激光器稱為耗盡激光器（STED激光器），它激發“甜甜圈”形狀的激光，其中心的零強度點非常小（?30 nm）（未激發）。除了在甜甜圈的中心處之外，第二激光起到了“關閉”**激光所產生的外圈熒光，從而將樣本激發的熒光分子範圍縮小到中心圓點處，這有效地降低了PSF，以產生非常小的單分子熒光聚焦區域，從而獲得高分辨率圖像。

1.單個小於250 nm的蛋白質無法通過標準共聚焦成像解析，從而導致圖像模糊

2.STED耗盡激光器產生了淬滅外圍熒光的“甜甜圈”

3.飽和耗盡在功能上降低了激勵PSF

4.隨之可以解析單個蛋白質

適用於STED的熒光團偶聯抗體：

為了獲得超分辨率，染料必須具有STED激光波長的高發射截麵，並有效地實現高飽和度。這種強烈的照明確保了所有被STED激光“關閉”的分子都受受激發射的支配。合適的染料應具有低的光漂白性，具有高的量子產率和對比度，並在目標附近具有足夠的標記密度。如下列染料標記的二抗已被驗證在STED中成功使用：

Alexa Fluor 488標記親和純化山羊抗小鼠IgG（H+L）二抗，#115-545-003

與傳統的熒光團相比，具有發光亮度更強，靈敏度更高，背景更低的優勢，同時其對pH的穩定性更好，發光 也更持久，因此更適合於拍照。Alexa Fluor熒光熒光染料作為熒光顯微鏡、細胞生物學和分子生物學內的生物分子、細胞和組織標記物，可應用於生物技術和研 究等眾多領域。

二、隨機光學重建顯微鏡（STORM）

*初所有的熒光標簽都是暗的。然後使用激光脈衝來激活一小部分熒光標簽，隨後使用另一束光來關閉這些熒光標簽。不斷重複這個過程，生成一係列部分熒光圖，*後重建成整個視野的熒光圖。以產生分辨率優於常規方法收集的圖像。

使用超分辨率隨機光學重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)，科學家首次觀察到了神經元軸突的細胞骨架。

用於單分子定位實驗的熒光團偶聯抗體

用於單分子定位的*佳染料通常非常亮，並產生足夠的光子以可靠地產生緊密的高斯分布。例如艾美捷Jackson 的AlexaFluor®488，AlexaFluor®647和Cy™5，可用於這些類型的實驗。建議用於超分辨顯微鏡的熒光染料偶聯物。

每種SRM技術都有各自的探針選擇要求，需要注意的是，SRM領域變化迅速，因此，建議從專業技術文獻中尋求信息，以幫助選擇合適的熒光團。