激光掃描共聚焦熒光顯微鏡的成像原理和基本結構 - 分析行業必一体育sport网页版登录

    激光掃描共聚焦熒光顯微鏡是一種利用計算機、激光和圖像處理技術獲得生物樣品三維數據、先進的分子細胞生物學的分析儀器。主要用於觀察活細胞結構及特定分子、離子的生物學變化，定量分析，以及實時定量測定等。
 

　　成像原理
 

　　采用點光源照射標本，在焦平麵上形成一個輪廓分明的小的光點，該點被照射後發出的熒光被物鏡收集，並沿原照射光路回送到由雙向色鏡構成的分光器。分光器將熒光直接送到探測器。光源和探測器前方都各有一個針孔，分別稱為照明針孔和探測針孔。兩者的幾何尺寸一致，約100-200nm；相對於焦平麵上的光點，兩者是共軛的，即光點通過一係列的透鏡，*終可同時聚焦於照明針孔和探測針孔。這樣，來自焦平麵的光，可以會聚在探測孔範圍之內，而來自焦平麵上方或下方的散射光都被擋在探測孔之外而不能成像。以激光逐點掃描樣品，探測針孔後的光電倍增管也逐點獲得對應光點的共聚焦圖像 ，轉為數字信號傳輸至計算機，*終在屏幕上聚合成清晰的整個焦平麵的共聚焦圖像。
 

　　每一幅焦平麵圖像實際上是標本的光學橫切麵，這個光學橫切麵總是有一定厚度的，又稱為光學薄片。由於焦點處的光強遠大於非焦點處的光強，而且非焦平麵光被針孔濾去，因此共聚焦係統的景深近似為零，沿Z軸方向的掃描可以實現光學斷層掃描，形成待觀察樣品聚焦光斑處二維的光學切片。把X-Y平麵(焦平麵)掃描與Z軸(光軸)掃描相結合，通過累加連續層次的二維圖像，經過專門的計算機軟件處理，可以獲得樣品的三維圖像。即檢測針孔和光源針孔始終聚焦於同一點，使聚焦平麵以外被激發的熒光不能進入檢測針孔。
 

　　激光共聚焦的工作原理簡單表達就是它采用激光為光源，在傳統熒光顯微鏡成像的基礎上，附加了激光掃描裝置和共軛聚焦裝置，通過計算機控製來進行數字化圖像采集和處理的係統。
 

　　基本結構
 

　　激光掃描共聚焦顯微鏡係統主要包括掃描模塊、激光光源、熒光顯微鏡、數字信號處理器、計算機以及圖像輸出設備等。
 

　　（1）掃描模塊
 

　　掃描模塊主要由針孔光欄(控製光學切片的厚度)、分光鏡(按波長改變光線傳播方向)、發射熒光分色器(選擇一定波長範圍的光進行檢測)、檢測器(光電倍增管)組成。熒光樣品中的混合熒光進入掃描器，經過檢測針孔光欄、分光鏡和分色器選擇後，被分成各單色熒光，分別在不同的熒光通道進行檢測並形成相應的共焦圖象，同時在計算機屏幕上可以顯示幾個並列的單色熒光圖象及其合成圖象。
 

　　（2）熒光顯微鏡係統
 

　　顯微鏡是LSCM的主要組件，它關係到係統的成像質量。顯微鏡光路以無限遠光學係統可方便地在其中插入光學選件而不影響成像質量和測量精度。物鏡應選取大數值孔徑平場複消色差物鏡，有利於熒光的采集和成像的清晰。物鏡組的轉換，濾色片組的選取，載物台的移動調節，焦平麵的記憶鎖定都應由計算機自動控製。
 

　　激光掃描共聚焦顯微鏡所用的熒光顯微鏡大體與常規熒光顯微鏡相同，但又有其特點：需與掃描器連接，使激光能進入顯微鏡物鏡照射樣品，並使樣品發射的熒光到達檢測器；需有光路轉換裝置，即汞燈與激光轉換，同時汞燈光線強度可調。
 

　　（3）常用激光器
 

　　激光掃描共聚焦顯微鏡使用的激光光源有單激光和多激光係統，常用的激光器包括以下三種類型：
 

　　半導體激光器：405nm(近紫外譜線)
 

　　氬離子激光器：457nm、477nm、488nm、514nm(藍綠光)
 

　　氦氖激光器：543nm(綠光-氦氖綠激光器)633nm (紅光—氦氖紅激光器)
 

　　UV激光器(紫外激光器)：351 nm、364 nm(紫外光)
 

　　（4）輔助設備
 

　　風冷、水冷冷卻係統及穩壓電源。
 

　　激光掃描共聚焦顯微鏡的基本工作原理是首先由激光器發射的一定波長的激發光，光線經放大後通過掃描器內的照明針孔光欄形成點光源，由物鏡聚焦於樣品的焦平麵上，樣品上相應的被照射點受激發而發射出的熒光，通過檢測孔光欄後，到達檢測器，並成像於計算機監視屏上。這樣由焦平麵上樣品的的每一點的熒光圖像組成了一幅完整的共焦圖像，稱為光切片。