超分辨率顯微鏡發展曆程和技術原理 - 分析行業必一体育sport网页版登录

超分辨率顯微鏡發展曆程 

毫無疑問，自16世紀以來，光學顯微鏡已經曆漫長的旅程。首次被知曉的複合顯微鏡是由Zacharias和Hans Janssen構造的。盡管這些顯微鏡沒有保存下來，但人們確信這些顯微鏡已能夠將放大倍率從3倍提高到9倍。17世紀末期，Leeuwenhoek首次將放大倍率和分辨率提高到細胞水平。他存留下來的顯微鏡有275倍的放大倍率和令人震驚的1μm分辨率。在19世紀晚期，Ernst Abbe發現光學顯微鏡的分辨率是由入射光波長和顯微鏡數值孔徑的函數關係決定的。這一發現使分辨極限達到220nm左右。在之後的約100年內，顯微鏡學家始終停留在這一分辨極限。空間分辨率的限製排除了光學顯微鏡分辨亞細胞結構如核糖體、囊泡以及其他分子相互作用的可能性，這些物質尺寸均在光學顯微鏡的分辨能力之下。

20世紀30年代後期，德國科學家Ernst Ruska發明了電子顯微鏡，它的出現並不久，而Max Knoll推動其分辨率極限低至10埃左右。這是一個不可思議的壯舉。不幾年後，生物學家就開始利用這種新型的工具。1945年3月，Keith Porter, Albert Claude和Ernest Fullam 在論文“電子顯微鏡用於組織培養細胞的研究”中發表了**張單個細胞的電子顯微鏡照片，文章發表在Journal of Experimental Medicine上。接下來的幾十年湧現出大量由生物學家利用TEM揭示詳細和複雜超微結構的實驗工作。

然而，生物顯微鏡的目的是了解細胞存活時如何發揮機能。“細胞生命”則是科學家為得到TEM驚人分辨率所需付出的代價。細胞樣品要求被固定、脫水、包埋於塑型劑並切成超薄切片。這就產生了一個高度加工和*終長時間操作的樣品的二維圖像。bsports官网登录花了很長時間尋找合適的固定劑和緩衝劑，以*大限度地減少人工操作。同樣，利用超薄連續切片，目前三維的細胞重構也成為可能，但數據仍然僅呈現一個快照的時間。而生命是動態的，它的周期超過一個快照的時間。

接下來這一領域出現了超高分辨率顯微鏡。為充分認識動態 生命進程，bsports官网登录需要推進光的分辨率極限，並將熒光和共聚焦成像的先進技術應用於亞細胞水平。bsports官网登录需要能夠應用於活細胞的更高分辨率。1978年，兄弟Thomashe和Christopher Cremer兩人在Microscopia Acta上發表了“對具有高分辨率和穿透深度的激光掃描顯微鏡的思考”。文章中的觀測數據開啟了在光的衍射極限之下的觀測的大門。

超高分辨率顯微鏡的代表技術包括：STED,PALM,STORM,SIM；所有主要的顯微鏡供應商，如萊卡、蔡司和尼康，均提供商品化超分辨率顯微鏡部件，分辨率低至20納米並非罕見的要求。即使是規模較小運營不久的公司，如猶他州的Vutara，號稱有**款3D超分辨率顯微鏡，也進軍這一領域。這一分辨水平的活細胞成像變的十分普遍，在大量文獻中都能看到。

超分辨率顯微鏡技術原理、熒光抗體 

1873年，德國醫師Ernst Abbe 提出了“衍射極限”的概念。他預測，由於光的基本衍射性質，光學顯微鏡無法實現200nm以下的分辨率。實際上，當兩個相隔很近的物點同時發光時，得到的圖像是模糊的，無法分辨。超分辨率顯微鏡（SRM）的誕生打破了一個世紀多以來一直被認為無法突破的瓶頸。 

如今，科學家們已經研發了多種超分辨率技術，遠遠超出了衍射極限，能夠觀察到分子尺度的細節。SRM技術可以將細胞結構解析為亞細胞水平，從而獲取有關細胞組分的3D結構的信息，並可以觀察到單分子共定位。 

以下概述了時下幾種*流行的SRM技術的原理： 

1.受激發射耗竭（STED）顯微鏡 

STED對於有經驗的熒光顯微鏡使用者來說相對簡單，該方法和普通共聚焦顯微鏡（Confocal）的原理相同。普通Confocal使用單光源，而STED使用雙光源。其中一個光源發射能激發熒光團——熒光標簽（研究者們以此來定位和觀察蛋白）的光，另一個光源發出不同波長的光，用於抑製熒光。這束光是環形的，並且與**束光有所重疊，因此隻有環形中間區域的分子會繼續發出熒光。 

獲得STED超分辨率圖片並沒有那麽複雜，用戶需要仔細調整參數，才能得到漂亮的結果，否則所得圖片和普通confocal沒有差別。 

使用傳統和RESCue受激發射減損顯微鏡（STED）得到的細胞核膜上核孔複合體的圖片 

STED的原理： 

顯微鏡透鏡對光的衍射會導致來自單個點的光出現在較大的區域，這稱為點擴散函數（PSF）（見圖1），由於PSF的存在，使得常規顯微鏡無法達到超分辨。 

圖1：在普通光學顯微鏡中，成像是通過將來自點光源的光線會聚到像平麵上的單個點來實現的。超出光衍射的限製，防止了射線的精確會聚，從而導致物體的圖像模糊。顯微鏡的分辨率取決於點擴散函數（PSF）的大小，或對象在某個點的三維強度分布。在STED中，應用環形炸彈耗盡型激光器，其零點與激發激光焦點的*大值重疊。STED激光器引起熒光的“飽和耗盡”，從而“抑製了來自零點附近區域的熒光，導致有效PSF的尺寸減小”。

而受激發射耗竭（STED）顯微鏡通過限製樣品的熒光區域（PSF）產生超分辨率圖像。STED顯微鏡使用兩個重疊的激光，**個按照常規顯微鏡激發熒光團（圖2A）。第二個激光器稱為耗盡激光器（STED激光器），它激發“甜甜圈”形狀的激光，其中心的零強度點非常小（?30 nm）（未激發）。除了在甜甜圈的中心處之外，第二激光起到了“關閉”**激光所產生的外圈熒光，從而將樣本激發的熒光分子範圍縮小到中心圓點處，這有效地降低了PSF，以產生非常小的單分子熒光聚焦區域，從而獲得高分辨率圖像（圖2D）。

圖2：

1. 單個小於250 nm的蛋白質無法通過標準共聚焦成像解析，從而導致圖像模糊

2. STED耗盡激光器產生了淬滅外圍熒光的“甜甜圈”

3. 飽和耗盡在功能上降低了激勵PSF

4. 隨之可以解析單個蛋白質

適用於STED的熒光團偶聯抗體： 

為了獲得超分辨率，染料必須具有STED激光波長的高發射截麵，並有效地實現高飽和度。這種強烈的照明確保了所有被STED激光“關閉”的分子都受受激發射的支配。合適的染料應具有低的光漂白性，具有高的量子產率和對比度，並在目標附近具有足夠的標記密度。 

Jackson提供熒光染料標記的二抗，下列染料標記的二抗已被驗證在STED中成功使用： AlexaFluor?488（如：115-545-003），FITC（如：715-095-150），AlexaFluor?594（如：715-585-151）和AlexaFluor?647。

2. 隨機光學重建顯微鏡（STORM） 

*有名的“基於探針”的技術是Betzig等人研發的光激活定位顯微技術（photoactivated localization microscopy, PALM）和哈佛大學莊小威實驗室發明的隨機光學重建顯微技術(stochastic optical reconstruction microscopy, STORM)。*初所有的熒光標簽都是暗的。然後使用激光脈衝來激活一小部分熒光標簽，隨後使用另一束光來關閉這些熒光標簽。不斷重複這個過程，生成一係列部分熒光圖，*後重建成整個視野的熒光圖。，以產生分辨率優於常規方法收集的圖像。

使用超分辨率隨機光學重建顯微鏡(stochastic optical reconstruction microscopy，STORM)，科學家首次觀察到了神經元軸突的細胞骨架。 

Jackson提供適用於dSTORM應用的標記二抗，簡而言之，較低強度的激發光激發樣品，隨機激活少量染料分子。單個發熒光的染料分子足夠分散，因此可以計算其點擴散函數的中心，從而推斷出染料的確切位置。然後使用第二激光關閉所有分子，並重複該過程。然後，通過重疊每種染料的所有映射點擴展函數，以數學方式生成高分辨率圖像。 

用於單分子定位實驗的熒光團偶聯抗體 

用於單分子定位的*佳染料通常非常亮，並產生足夠的光子以可靠地產生緊密的高斯分布。Jackson ImmunoResearch提供了多種廣譜範圍內的可靠染料，例如AlexaFluor 488，AlexaFluor 647和Cy 5，可用於這些類型的實驗。

建議用於超分辨率顯微鏡的熒光染料偶聯物： 

每種SRM技術都有各自的探針選擇要求，Jackson ImmunoResearch提供多種已知在SRM應用中表現良好的熒光標記二抗。應該注意的是，SRM領域變化迅速，因此，建議從專業技術文獻中尋求信息，以幫助選擇合適的熒光團。